Alcune città importanti su una mappa del fiume Ohio sono Pittsburgh, in Pennsylvania; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, West Virginia; e Evansville, Indiana. Altri luoghi notevoli lungo il fiume Ohio sono le città della West Virginia di Parkersburg, Wheeling e Weirton, così come la città di Owensboro, nel Kentucky.
L'Ohio River inizia a Pittsburgh. Da lì, il fiume scorre a nord dalle città della Pennsylvania di Sewickley, Coraopolis, Ambridge e Aliquippa. Alla città di Rochester, il fiume Ohio si trasforma a ovest. Il fiume passa poi dalle città di Beaver e Midland prima di raggiungere il confine della Pennsylvania con lo stato dell'Ohio.
Dopo aver superato la città dell'Ohio di East Liverpool, il fiume si trasforma a sud. La rotta del fiume definisce il confine dell'Ohio con la Virginia dell'Ovest. Le città sul lato dell'Ohio del fiume includono Steubenville, Martins Ferry, Marietta e Gallipolis. Le città sul lato occidentale del fiume Virginia comprendono Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant e Huntington.
Intorno alla città dell'Ohio di Ironton, il fiume Ohio inizia a definire il confine tra gli stati dell'Ohio e del Kentucky. Alcune città del Kentucky oltre il confine dall'Ohio includono Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville e Newport. Dopo che il fiume supera Cincinnati, il fiume inizia a definire il confine del Kentucky con l'Indiana. Dopo aver superato la città dell'Indiana di Mount Wilson, il fiume Ohio definisce il confine del Kentucky con l'Illinois. Il fiume Ohio si svuota nel fiume Mississippi a Cairo, nell'Illinois.
