I campioni di coltura che hanno superato le 24 ore di età possono macchiarsi in modo errato, perdendo la loro capacità di trattenere la colorazione viola di cristallo. Possono apparire come organismi gram-negativi quando sono in realtà gram-positivi, oppure il campione può mostrare un risultato gram-variabile.
Le colorazioni di Gram rivelano le differenze strutturali nelle pareti cellulari degli organismi in laboratorio. Gli organismi Gram-positivi hanno una parete cellulare spessa contenente fino al 90% di peptidoglicano e appaiono blu o viola al microscopio dopo la colorazione con il cristal violetto. Gli organismi Gram-negativi hanno una parete cellulare molto più sottile contenente fino al 10% di peptidoglicano e un alto contenuto lipidico. Questi microrganismi appaiono rossi o rosa sotto il microscopio dopo la colorazione con il cristal violetto.
La colorazione di Gram è un test di laboratorio critico che è parte integrante dello studio e del trattamento delle malattie infettive. Molti antibiotici funzionano su organismi gram-negativi o gram-positivi a causa del modo in cui abbattono le pareti cellulari. Gli antibiotici ad ampio spettro funzionano su organismi gram-negativi e gram-positivi.
La macchia di Gram fu creata da Hans Christian Gram nel 1884. Stava cercando un modo per visualizzare i cocchi nei campioni di tessuto polmonare di coloro che erano morti per polmonite. Ha usato il cristallo viola come sua macchia primaria, seguito da iodio come fissatore e etanolo come decolorante. La fase di decolorazione crea la perdita della colorazione blu-viola che differenzia gli organismi gram-positivi e negativi l'uno dall'altro.
