Gli ingredienti principali dell'inchiostro evidenziatore sono acqua e glicole solvente. Circa il 5 percento dell'inchiostro è pigmento fluorescente o colorante. Alcuni evidenziatori contengono anche una piccola quantità di biocida per prevenire la crescita di funghi e batteri.
I coloranti utilizzati nelle penne di evidenziazione gialle sono a base di pirene. Evidenziatori blu contengono colorante trifenilmetano. La tintura trifenilmetanica combinata con la piranina produce inchiostro di evidenziazione verde. Evidenziatori rosa contengono rodamina. Gli evidenziatori viola sono fatti con rodamina miscelata con trifenilmetano. Lo xantene combinato con cumarina produce inchiostro per evidenziatore viola.
Le molecole chimiche dell'inchiostro evidenziatore assorbono la luce ultravioletta. Questo "eccita" gli elettroni all'interno delle molecole, che rilasciano quindi una forma d'onda leggermente più lunga della luce. Questa interazione di luce e sostanze chimiche è interpretata dall'occhio come fluorescenza.
