Il calore è necessario quando si macchiano le spore perché l'applicazione del calore distrugge le cellule vegetative e fa sì che la malachite verde sia sciacquata da esse, il che consente poi il colorante di contrasto nelle cellule. Questo è un passaggio obbligato in certe spore resistenti ai metodi tradizionali di colorazione delle spore.
Secondo Austin Community College, la colorazione è una tecnica utilizzata dagli scienziati per identificare le spore in un campione di batteri. Uno dei passaggi più importanti nella colorazione delle spore consiste nell'anticipare le proprietà delle spore che vengono analizzate, poiché alcune di esse sono resistenti ai processi di tintura tradizionali. Spesso, questo è il risultato del loro duro strato esterno di proteine, noto come cheratina. Per endospore di questa natura, è necessario utilizzare una tecnica di colorazione a caldo per colorare le spore con la loro macchia primaria, il verde malachite.
L'applicazione del calore indebolisce il muro di una cellula e permette che venga sciacquato e permeato dai coloranti. La cellula originale che forma un endospora è chiamata cellula vegetativa. Queste cellule sono più sensibili al calore delle endospore stesse e possono essere sciacquate e tinte con verde malachite. Sulla base del rigonfiamento e delle reazioni delle endospore, questo processo di tintura può quindi essere utilizzato per identificare spore con strati protettivi e resistenti.
