Le differenze tra batteri Gram-positivi e Gram-negativi includono lo spessore della parete cellulare, che è spessa approssimativamente da 20 a 30 nanometri in Gram-positivi e da 8 a 12 nanometri in Gram-negativi; la quantità di peptidoglicano nelle pareti cellulari; e il contenuto di lipidi e lipoproteine, che è basso nei batteri Gram-positivi e alto in Gram-negativi. Usando il processo di colorazione di Gram, i batteri Gram positivi producono una tonalità viola, mentre i risultati Gram negativi in rosa.
Tutti i batteri contengono uno strato di peptidoglicano nella loro parete cellulare, ma la differenza tra i batteri Gram positivi e Gram negativi è che il Gram negativo ha uno strato sottile di peptidoglicano situato tra due strati lipidici. Questo è ciò che dà ai batteri Gram positivi una colorazione rosa o rossa nel processo di colorazione di Gram. I batteri Gram-positivi, d'altra parte, producono una tonalità viola o viola a causa dello spesso strato di peptidoglicano situato nelle loro pareti cellulari. Il processo di colorazione di Gram, scoperto da Hans Christian Gram, aiuta a identificare i batteri.
Un'altra differenza tra batteri Gram positivi e Gram negativi è nella struttura del flagello, con Gram positivo contenente due anelli nel corpo basale e Gram negativo contenente quattro anelli nel corpo basale. I batteri Gram-positivi hanno un'alta suscettibilità ai trattamenti con penicillina e sulfonamide, mentre i batteri Gram-negativi hanno una bassa suscettibilità.