La fase di decolorazione è la più critica nella colorazione di Gram. L'esito di questo passaggio si basa sulla facilità con cui la cellula rilascia il complesso cristallo-iodio-violetto.
Scoperto dal Dr. Hans Christian Gram nel 1884, la colorazione di Gram è una macchia differenziale che viene utilizzata per identificare i batteri. Dividendo le cellule batteriche in due gruppi principali (Gram-positivi e Gram-negativi), è uno strumento fondamentale per la classificazione e la differenziazione dei batteri. Le due macchie richieste sono il primario e il controcolorazione. La sovra-decolorazione causa la scomparsa della macchia primaria e Gram positivo appare Gram negativo. D'altro canto, la decolorazione non rimuove il complesso di cristalli di iodio violento, il che fa apparire positivi i batteri Gram negativi.
