Le macchie negative non colorano le cellule perché la parete cellulare dei batteri respinge la tintura. I coloranti usati per le macchie negative sono acidi e non penetrano nelle pareti cellulari cariche negativamente. Per questo motivo, solo lo sfondo della diapositiva sarà colorato.
Il vantaggio principale dell'uso di una macchia negativa su una macchia positiva è che le macchie negative possono essere eseguite senza dover riscaldare il campione, consentendo al campione di essere preservato il più possibile senza distorsioni. Utilizzando questa procedura, la morfologia, la disposizione e le dimensioni dei batteri sono preservate e possono essere determinate con maggiore precisione.
