La fosforilazione ossidativa si verifica all'interno e intorno alle membrane dei mitocondri nelle cellule eucariotiche. La fosforilazione ossidativa è il processo di generazione di adenosina trifosfato, la principale valuta energetica di tutte le cellule, utilizzando l'ossigeno come elettrone finale accettore. I due passaggi principali della fosforilazione ossidativa sono il trasporto degli elettroni e la chemiosmosi, che utilizzano entrambi il movimento di particelle cariche per trasferire energia.
La fosforilazione ossidativa è il metodo principale con cui le cellule eucariotiche producono ATP in modo aerobico. Il passo prima della fosforilazione ossidativa, la glicolisi, crea ATP, ma in quantità molto minori. Anche la glicolisi si svolge lontano dai mitocondri. La fosforilazione ossidativa inizia usando il trasporto degli elettroni per spostare gli elettroni tra varie molecole nei mitocondri. Questo serve anche a disegnare i protoni, che sono nuclei di idrogeno senza elettroni, attraverso la membrana dei mitocondri. Questo movimento si trova in un'area di maggiore concentrazione contro le tendenze della diffusione. In quanto tale, richiede energia.
Una volta che gli elettroni smettono di muovere i protoni, vengono liberati per viaggiare indietro attraverso la membrana mitocondriale in un processo noto come chemiosmosis. Il processo di spostamento dei protoni in una direzione richiedeva energia, e il movimento spontaneo attraverso la membrana lo libera. È questa energia che viene utilizzata per legare un gruppo fosfato ad ADP, creando ATP.